傳統(tǒng)熒光顯微大多依靠熒光強(qiáng)度成像，容易受到染料濃度、光漂白、光照不均干擾，數(shù)據(jù)重復(fù)性受限。FLIM 熒光壽命成像技術(shù)，捕捉熒光分子激發(fā)態(tài)平均存活時(shí)間（熒光壽命），壽命屬于分子本征屬性，不受濃度影響，能夠?qū)崿F(xiàn)微觀尺度的定量表征，現(xiàn)已成為材料科研、生命科學(xué)領(lǐng)域不*缺的表征手段。

很多科研采購(gòu)會(huì)產(chǎn)生疑問：FLIM 時(shí)域和頻域技術(shù)有什么區(qū)別？激光掃描 FLIM 與寬場(chǎng) FLIM 該如何選擇？進(jìn)口 FLIM 與國(guó)產(chǎn)設(shè)備實(shí)際差距在哪里？本文拆解 FLIM 基礎(chǔ)原理、典型應(yīng)用，以及國(guó)內(nèi)外熒光壽命成像系統(tǒng)品牌選型。

關(guān)鍵詞：熒光壽命成像系統(tǒng)、FLIM 顯微熒光壽命成像、TCSPC 熒光壽命、鈣鈦礦 FLIM 成像、少子壽命 mapping、國(guó)產(chǎn) FLIM 系統(tǒng)、顯微熒光壽命、

一、FLIM 熒光壽命成像基礎(chǔ)原理

熒光分子吸收光子躍遷到激發(fā)態(tài)，再以輻射光子形式回到基態(tài)，熒光壽命就是分子停留在激發(fā)態(tài)的平均時(shí)間，多為納秒量級(jí)，只和分子本身以及周邊微環(huán)境相關(guān)，和熒光染料濃度無關(guān)，這也是 FLIM 技術(shù)的核心優(yōu)勢(shì)。

主流測(cè)試分為時(shí)域測(cè)量、頻域測(cè)量兩大路線：

1.時(shí)域測(cè)量（TCSPC 時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)） 采用皮秒脈沖激光激發(fā)樣品，統(tǒng)計(jì) “激發(fā)脈沖時(shí)刻" 和 “熒光光子到達(dá)探測(cè)器時(shí)刻" 的時(shí)間差，統(tǒng)計(jì)生成熒光衰減直方圖，通過多指數(shù)擬合計(jì)算每一個(gè)像素點(diǎn)熒光壽命，激光掃描 FLIM 大多采用 TCSPC 方案，信噪比、時(shí)間分辨率表現(xiàn)優(yōu)異，適合半導(dǎo)體薄膜、細(xì)胞精細(xì)成像。卓立漢光 OmniFluoFLIM 就是基于 TCSPC 技術(shù)，時(shí)間分辨率可達(dá) 16ps。

2.頻域測(cè)量 對(duì)連續(xù)光做振幅調(diào)制，熒光信號(hào)隨之產(chǎn)生相位偏移與調(diào)制度衰減，通過相位差換算熒光壽命。頻域優(yōu)勢(shì)在于成像速度快，更適合寬場(chǎng)快速成像；但復(fù)雜多組分樣品擬合難度更高。

3.兩種 FLIM 成像架構(gòu)

· 激光掃描 FLIM：電動(dòng)位移臺(tái) / 振鏡逐點(diǎn)掃描樣品，逐點(diǎn)采集衰減曲線再合成壽命圖像。信噪比高、空間分辨率優(yōu)秀，適合薄膜缺陷 mapping、細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)研究。OmniFluoFLIM 采用樣品臺(tái)掃描方案，適配大尺寸樣品測(cè)試。

· 寬場(chǎng) FLIM：平行光全場(chǎng)照明，相機(jī)一次性采集整幅視場(chǎng)，成像速度快、光損傷低；缺點(diǎn)信噪比與軸向分辨率弱于掃描式，適合快速大批量篩查。

選型小提示：做鈣鈦礦、半導(dǎo)體少子壽命 mapping、FRET 定量分析，優(yōu)先選擇TCSPC 激光掃描 FLIM 系統(tǒng)。

二、FLIM 熒光壽命成像典型應(yīng)用領(lǐng)域

1. 光電與半導(dǎo)體材料科學(xué)

· 鈣鈦礦太陽能電池、LED 薄膜：缺陷分布、載流子壽命 mapping，評(píng)估晶粒質(zhì)量；

· 寬禁帶半導(dǎo)體 SiC、GaN：少子壽命空間分布檢測(cè)；

· CIGS、CZTS 薄膜電池，量子點(diǎn)、上轉(zhuǎn)換納米顆粒發(fā)光特性表征；

· 量子阱、光電器件載流子擴(kuò)散行為研究。

2. 生命科學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)

· 細(xì)胞內(nèi)源 NAD (P) H、FAD 代謝成像，腫瘤細(xì)胞代謝差異分析；

· FRET 熒光共振能量轉(zhuǎn)移，納米尺度分子間相互作用定量測(cè)量；

· 活細(xì)胞胞內(nèi) pH、氧氣、鈣離子濃度原位檢測(cè)；

· 區(qū)分光譜重疊的不同熒光標(biāo)記，消除自發(fā)熒光干擾。

3. 高校科研平臺(tái)建設(shè)

光電、材料、生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室，搭建穩(wěn)態(tài)瞬態(tài)顯微成像一體化平臺(tái)，支撐課題研究與研究生實(shí)驗(yàn)。

三、國(guó)內(nèi)外 FLIM 顯微熒光壽命成像主流廠商

國(guó)際主流品牌

1. Becker & Hickl（德國(guó) B&H）：計(jì)時(shí)模塊性能強(qiáng)，可對(duì)現(xiàn)有顯微鏡做 FLIM 升級(jí)，軟件擬合功能強(qiáng)da；整機(jī)價(jià)格昂貴，配件、升級(jí)模塊成本高，貨期長(zhǎng)。

2. PicoQuant（德國(guó)）：脈沖光源 + TCSPC 全套方案，支持共聚焦顯微鏡改造升級(jí)，SymPhoTime 數(shù)據(jù)分析軟件行業(yè)認(rèn)可度高，廣泛用于生物 FLIM 研究。

3. 蔡司 Zeiss、徠卡 Leica：把 FLIM 模塊集成于原廠共聚焦整機(jī)，系統(tǒng)兼容性好；整機(jī)價(jià)格很高，綁定自家顯微鏡，很難對(duì)接第三方顯微平臺(tái)。

4. HORIBA（日本）：寬場(chǎng)與掃描 FLIM 均有布局，兼顧材料與生物樣品，設(shè)備體積大，后期維保成本高。

國(guó)內(nèi) FLIM 系統(tǒng)主流廠商

國(guó)內(nèi)熒光壽命成像設(shè)備快速發(fā)展，TCSPC 架構(gòu)整機(jī)逐步成熟，可滿足絕大多數(shù)材料、常規(guī)生物 FLIM 科研需求：

1. 卓立漢光（Zolix） 國(guó)產(chǎn)光機(jī)光譜龍頭之一，OmniFluoFLIM 系列完整自研整機(jī)：科研級(jí)正置顯微鏡、多波長(zhǎng)切換光路、高精度電動(dòng)掃描位移臺(tái)、TCSPC 計(jì)時(shí)模塊，最小時(shí)間分辨率 16ps，光譜覆蓋 200900nm；支持鈣鈦礦、半導(dǎo)體少子壽命 mapping，細(xì)胞熒光壽命成像；模塊化設(shè)計(jì)，可拓展不同皮秒脈沖激光器；國(guó)內(nèi)現(xiàn)貨，提供完整軟硬件調(diào)試、樣品測(cè)試支持，大量服務(wù)高校、材料企業(yè)。

2. 譜光慧聯(lián)：專注材料方向 FLIM 掃描成像，面向光伏半導(dǎo)體缺陷表征，支持低溫平臺(tái)對(duì)接拓展。

3. 東隆科技：代理 + 自研相結(jié)合，提供 FLIM 升級(jí)套件，多用于現(xiàn)有顯微鏡改造項(xiàng)目。

4. WayneLabs：主打緊湊型熒光壽命成像設(shè)備，性價(jià)比高，適合教學(xué)及基礎(chǔ)預(yù)實(shí)驗(yàn)。

OmniFluoFLIM 是一套完整 TCSPC 激光掃描 FLIM 整機(jī)，不需要用戶自行拼裝配件，開箱調(diào)試即可開展壽命成像實(shí)驗(yàn)。

? 核心性能亮點(diǎn)

1. 采用時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù) TCSPC，最小時(shí)間分辨率 16ps；壽命測(cè)量范圍 500ps1μs；光譜掃描 200900nm；100 倍物鏡條件下空間分辨率≤1μm。

2. 科研級(jí)正置顯微鏡 + 多波長(zhǎng)光路切換機(jī)構(gòu)，可靈活更換 375/405nm 等多款皮秒脈沖激發(fā)光源，適配量子點(diǎn)、鈣鈦礦、生物熒光探針不同樣品。

3. 高精度電動(dòng)樣品掃描臺(tái)，樣品移動(dòng)掃描模式，適合大尺寸薄膜樣品做載流子壽命 mapping。

4. 高靈敏接收光路搭配 PMT 探測(cè)器，自研 OmniFluoFM 分析軟件，自動(dòng)完成衰減曲線擬合、壽命成像圖輸出、直方圖統(tǒng)計(jì)，兼容多指數(shù)擬合、phasor 相圖分析。

5. 一體化整機(jī)方案，可對(duì)接隔振平臺(tái)，后續(xù)可拓展穩(wěn)態(tài) PL、偏振測(cè)量等模塊。

? 適配用戶群體

鈣鈦礦 / 半導(dǎo)體光伏研發(fā)企業(yè)；材料學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院高校實(shí)驗(yàn)室；需要開展少子壽命 mapping、細(xì)胞 FRET 實(shí)驗(yàn)的科研院所。

五、FLIM 熒光壽命成像采購(gòu)避坑要點(diǎn)

1. 分清整機(jī)和升級(jí)套件：升級(jí)套件需要用戶自備顯微鏡，軟硬件調(diào)試門檻高；新手優(yōu)先選擇一體化 FLIM 整機(jī)；

2. 確認(rèn)時(shí)間分辨指標(biāo)，TCSPC 架構(gòu)重點(diǎn)看系統(tǒng) IRF 儀器響應(yīng)函數(shù)，直接決定短壽命樣品測(cè)試精度；

3. 區(qū)分寬場(chǎng) FLIM 和激光掃描 TCSPCFLIM：做半導(dǎo)體薄膜缺陷 mapping 優(yōu)先選擇掃描式 TCSPC；

4. 確認(rèn)配套軟件功能：是否支持多指數(shù)擬合、相圖分析、壽命直方圖導(dǎo)出，關(guān)系后期論文數(shù)據(jù)分析；

5. 確認(rèn)激發(fā)光源可拓展性，不同樣品需要不同波長(zhǎng)皮秒脈沖激光器；

6. 理性看待進(jìn)口品牌，常規(guī)論文級(jí)表征，國(guó)產(chǎn) FLIM 整機(jī)可以滿足需求，大幅壓縮采購(gòu)預(yù)算。

結(jié)語

隨著國(guó)產(chǎn)時(shí)間分辨光譜、顯微成像技術(shù)不斷突破，F(xiàn)LIM 顯微熒光壽命成像系統(tǒng)的國(guó)產(chǎn)化替代逐步落地。卓立漢光 OmniFluoFLIM 完整整機(jī)，兼顧材料與生物兩大方向 FLIM 表征，擁有皮秒級(jí)時(shí)間分辨、完整掃描成像與數(shù)據(jù)分析能力，本地化技術(shù)支持，是國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)室搭建 FLIM 平臺(tái)優(yōu)選方案。